ژل الکتروفورز چیست؟
ژل الکتروفورز یا Gel Electrophoresis یکی از پرکاربردترین تکنیکهای آزمایشگاهی برای جداسازی، بررسی و گاهی خالصسازی DNA، RNA یا پروتئینهاست. در این روش، مولکولها تحت تأثیر میدان الکتریکی از میان یک ماتریس ژل حرکت میکنند و بر اساس اندازه، بار الکتریکی و شکل خود از یکدیگر جدا میشوند. برای بررسی DNA و RNA معمولاً از ژل آگارز و برای جداسازی دقیقتر قطعات کوچک DNA یا پروتئینها از ژل پلیآکریلآمید استفاده میشود. پس از پایان الکتروفورز، باندها با رنگهای فلورسنت یا روشهای رنگآمیزی مناسب آشکار شده و با یک مارکر اندازه مقایسه میشوند.
ژل الکتروفورز چیست؟
انواع، مراحل انجام، کاربردها و تفسیر نتایج
- ژل الکتروفورز برای جداسازی DNA، RNA یا پروتئینها استفاده میشود.
- مولکولها تحت تأثیر جریان برق در ژل حرکت میکنند.
- قطعات کوچکتر معمولاً سریعتر و مسافت بیشتری طی میکنند.
- ژل آگارز بیشتر برای DNA و RNA و ژل پلیآکریلآمید برای قطعات کوچکتر یا پروتئینها کاربرد دارد.
- نتایج بهصورت باندهایی روی ژل مشاهده میشوند.
- مقایسه باند نمونه با DNA Ladder یا Protein Ladder، اندازه تقریبی مولکول را مشخص میکند.
Gel Electrophoresis چیست؟
ژل الکتروفورز یک روش جداسازی آزمایشگاهی است که در آن مولکولهای دارای بار الکتریکی در یک میدان الکتریکی حرکت میکنند. ژل نقش یک شبکه متخلخل یا الک مولکولی را دارد؛ بنابراین عبور مولکولهای کوچکتر از منافذ ژل آسانتر است، اما مولکولهای بزرگتر با مقاومت بیشتری روبهرو میشوند.
سرعت و جهت حرکت مولکول به اندازه، بار خالص، شکل، شدت میدان الکتریکی، غلظت ژل، نوع بافر و اندازه منافذ ماتریس بستگی دارد. آگارز و پلیآکریلآمید دو ماتریس رایج در الکتروفورز هستند.
ژل الکتروفورز چگونه کار میکند؟
DNA و RNA به دلیل وجود گروههای فسفات دارای بار منفی هستند و از سمت کاتد به سمت آند حرکت میکنند. چون نسبت بار به جرم قطعات DNA تقریباً مشابه است، جداسازی آنها عمدتاً بر اساس طول قطعه انجام میشود.
در مورد پروتئینها، بار، اندازه و شکل همزمان مؤثرند. در SDS-PAGE با افزودن SDS، پروتئینها دناتوره شده و بار منفی تقریباً یکنواختی دریافت میکنند؛ بنابراین جداسازی بیشتر بر اساس وزن مولکولی صورت میگیرد.
اجزای اصلی سیستم ژل الکتروفورز
انواع ژل الکتروفورز
- DNA و RNA
- محصول PCR
- هضم آنزیمی
- پلاسمید و کلونینگ
- قطعات کوچک DNA
- تفکیک بالا
- پروتئینها
- الیگونوکلئوتیدها
- پروتئین دناتوره
- وزن مولکولی
- Western Blot
- حفظ ساختار طبیعی
- کمپلکسهای پروتئینی
- فعالیت آنزیمی
- قطعات بسیار بزرگ DNA
- میکروبیولوژی
- اپیدمیولوژی مولکولی
- Sanger
- STR
- Fragment Analysis
- اتوماسیون بالا
تفاوت ژل آگارز و پلیآکریلآمید
| ویژگی | ژل آگارز | پلیآکریلآمید |
|---|---|---|
| کاربرد اصلی | DNA و RNA | پروتئین و قطعات کوچک DNA |
| قدرت تفکیک | متوسط | بالا |
| نحوه اجرا | معمولاً افقی | معمولاً عمودی |
| آمادهسازی | سادهتر | حساستر و پیچیدهتر |
| اندازه منافذ | بزرگتر | کوچکتر و قابلکنترلتر |
| استخراج قطعه | آسانتر | دشوارتر |
| خطر مواد اولیه | نسبتاً کم | آکریلآمید پلیمریزهنشده سمی است |
| هزینه | معمولاً کمتر | معمولاً بیشتر |
مراحل انجام الکتروفورز DNA روی ژل آگارز
راهنمای تقریبی انتخاب درصد آگارز
| درصد ژل آگارز | محدوده تقریبی مناسب |
|---|---|
| 0.5% | قطعات بسیار بزرگ |
| 0.7% | 0.8–12 kb |
| 1% | 0.5–10 kb |
| 1.5% | 0.2–3 kb |
| 2% | 0.1–2 kb |
| 3% | قطعات کوچک و نزدیک به هم |
دستگاه ژل الکتروفورز چیست؟
سیستم ژل الکتروفورز معمولاً از تانک الکتروفورز و پاور ساپلای تشکیل میشود. تانک شامل محفظه بافر، الکترودها، سینی ژل و درپوش ایمنی است و در انواع افقی و عمودی عرضه میشود.
پاور ساپلای ولتاژ، جریان، توان و زمان ران را کنترل میکند. انتخاب نامناسب ولتاژ میتواند باعث گرمشدن، خمیدگی باندها و کاهش قدرت تفکیک شود.
سیستم Gel Documentation
این سیستم برای مشاهده، ثبت و تحلیل باندها استفاده میشود و ممکن است شامل دوربین دیجیتال، منبع UV یا Blue Light، فیلتر اپتیکی و نرمافزار اندازهگیری باند باشد.
کاربردهای Gel Electrophoresis
- وجود یا عدم وجود محصول
- اندازه تقریبی قطعه
- بررسی تخریب
- ارزیابی یکپارچگی نمونه
- بررسی کامل بودن هضم
- الگوی قطعات مورد انتظار
- کنترل PCR و پلاسمید
- استخراج قطعه از ژل
- SDS-PAGE
- خلوص و وزن مولکولی
- Western Blot
- STR و VNTR
- برخی حذف و اضافهشدگیها
- بررسی تعامل DNA و پروتئین
تفسیر باندهای ژل
- محصول اختصاصی در اندازه مورد انتظار
- نیاز احتمالی به روش تأییدی
- اتصال غیراختصاصی
- Annealing نامناسب
- طراحی نامناسب پرایمر
- آلودگی
- تخریب DNA
- بارگذاری زیاد
- نمک یا ولتاژ بالا
- PCR غیراختصاصی
- عدم تکثیر
- غلظت پایین
- خطای بارگذاری
- جهت اشتباه الکترود
- بارگذاری یا نوردهی بیشازحد
- گرمای غیریکنواخت
- ولتاژ زیاد
- بافر نامناسب
تفاوت Gel و Capillary Electrophoresis
| ویژگی | ژل معمولی | الکتروفورز موئینه |
|---|---|---|
| محیط جداسازی | ژل تخت | موئینه باریک |
| خودکار بودن | کم تا متوسط | زیاد |
| توان تفکیک | متوسط تا بالا | بسیار بالا |
| سرعت | معمولاً کمتر | بیشتر |
| تعداد نمونه | محدودتر | مناسب اتوماسیون |
| هزینه تجهیزات | کمتر | بیشتر |
| خروجی | تصویر باند | Electropherogram |
| کاربرد | PCR، DNA و پروتئین | Sanger، STR و Fragment Analysis |
تفاوت ژل الکتروفورز و Western Blot
| ویژگی | Gel Electrophoresis | Western Blot |
|---|---|---|
| هدف | جداسازی مولکولها | شناسایی اختصاصی پروتئین |
| انتقال به غشا | ندارد | دارد |
| آنتیبادی | نیاز ندارد | نیاز دارد |
| اطلاعات اندازه | دارد | دارد |
| شناسایی اختصاصی پروتئین | محدود | دارد |
مزایا و محدودیتهای ژل الکتروفورز
- روش ساده و شناختهشده
- هزینه نسبتاً پایین
- مشاهده مستقیم محصولات PCR
- تخمین اندازه قطعات
- کاربرد برای DNA، RNA و پروتئین
- امکان استخراج DNA از ژل
- مناسب کنترل کیفی
- اطلاعات محدود درباره هویت دقیق قطعه
- دقت کمتر از Capillary Electrophoresis
- حساسیت محدود در نمونههای کمغلظت
- خطر آلودگی پس از PCR
- آسیب احتمالی DNA با UV
- وابستگی شدید به شرایط ران
- تفسیر عمدتاً کیفی یا نیمهکمی
عوامل مؤثر بر کیفیت نتایج
کاربرد ژل الکتروفورز در آزمایشگاههای مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| ژنتیک مولکولی | بررسی محصولات PCR و جهشهای وابسته به اندازه |
| میکروبشناسی | بررسی PCR عوامل عفونی |
| تحقیقات | آنالیز DNA، RNA و پروتئین |
| بیوتکنولوژی | کلونینگ و تولید پروتئین |
| پزشکی قانونی | بررسی قطعات و مارکرهای ژنتیکی |
| داروسازی | کنترل پروتئینها و محصولات زیستی |
| زیستشناسی سلولی | بررسی بیان ژن و پروتئین |
وکتور چگونه میتواند در تأمین تجهیزات Gel Electrophoresis کمک کند؟
اجرای ژل الکتروفورز به مجموعهای از تجهیزات و مواد مصرفی وابسته است و انتخاب نادرست هر کدام میتواند باعث کاهش وضوح باندها یا تکرار آزمایش شود.
همیشه مشکل ژل نامناسب از PCR نیست. درصد نامناسب ژل، بافر قدیمی، حجم زیاد نمونه، گرمشدن تانک یا Ladder نامتناسب میتواند تصویر گمراهکننده ایجاد کند.
برای محصولات کوچک، ژل رقیق تفکیک مناسبی نمیدهد و برای قطعات بزرگ، ژل بسیار غلیظ حرکت را کند یا متوقف میکند.
در ژلهای پهن بهتر است Ladder در دو سمت ژل قرار گیرد تا اثر احتمالی انحنای مسیر حرکت کنترل شود.
محل آمادهسازی PCR باید از محل باز کردن محصولات PCR و تصویربرداری ژل جدا باشد تا خطر آلودگی آئروسل کاهش یابد.
برای استخراج DNA از ژل، زمان تماس با UV باید کوتاه باشد و در کاربردهای حساس، Blue Light گزینه مناسبتری است.
برندهای مطرح تجهیزات و مواد ژل الکتروفورز
- Bio-Rad
- Thermo Fisher Scientific
- Cleaver Scientific
- Major Science
- Hoefer
- Analytik Jena
- ATTO
- Thermo Fisher Scientific
- Bio-Rad
- Merck
- Promega
- Lonza
- GeneDireX
- New England Biolabs
- Takara Bio
- Bio-Rad
- Thermo Fisher Scientific
- Azure Biosystems
- Analytik Jena
- Vilber
- Syngene
- Cleaver Scientific
سؤالات متداول
منابع
- Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments
- Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols
- Stellwagen NC. Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution
- Nucleic Acid Gel Electrophoresis Workflow and Technical Guide
- Agarose Gel Electrophoresis and Horizontal Electrophoresis Guide
- Agarose Gel Electrophoresis Protocol